Nachdem Mary Stuart Masterson als Kind in dem Klassiker „Die Frauen von Stepford” (1975) zu sehen war, legte sie eine Pause ein, um ihre Ausbildung zu beenden. Sie kehrte mit herausragenden Leistungen in Mainstream-Filmen wie „Der steinerne Garten“ (1987), „Second Hand Familie“ (1989), „Grüne Tomaten“ (1991) und „Benny & Joon“ (1993) auf die Leinwand zurück. Außerdem war sie in verschiedenen TV-Serien wie „Law & Order: New York“ (2004–2007), „NCIS“ (2017–2019) und „For Life“ (2020) zu sehen. Ihr Spielfilm-Regiedebüt gab sie mit „The Cake Eaters“ (2007), einem Independent-Drama mit Kristen Stewart. In ihrer späteren Karriere übernahm sie Rollen in Filmen wie „Skin“ (2018), „Five Nights at Freddy’s“ (2023) und „The Senior“ (2025).